來自西北農(nóng)林科技大學(xué)的研究人員成功利用鋅指切口酶（zinc-finger nickases,ZFN）介導(dǎo)將溶葡萄球菌素（lysostaphin）基因插入到β-酪蛋白（beta-casein）基因座，由此構(gòu)建出了活產(chǎn)基因靶向性克隆牛。這一突破性的研究成果發(fā)表在10月14日的《自然通訊》（Nature Communications）雜志上。生物通 www.ebiotrade.com
領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是西北農(nóng)林科技大學(xué)的張涌（Yong Zhang）教授，其多年從事哺乳動(dòng)物發(fā)育生物工程理論和技術(shù)研究。是國家級(jí)“有突出貢獻(xiàn)專家”。
ZFN是一種適用于基因組工程操縱、實(shí)現(xiàn)定向突變的強(qiáng)有力的工具。ZFNs切割DNA，在基因組中生成位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂(DSBs)。或通過非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)雙鏈斷裂，往往會(huì)在連接斷點(diǎn)導(dǎo)入短的插入或缺失(indels)，或是通過同源重組修復(fù)（HDR）拷貝姐妹染色單體忠實(shí)地修復(fù)原始序列。盡管非同源末端連接是高等真核細(xì)胞和生物體主要的雙鏈斷裂修復(fù)信號(hào)通路，目前研究人員利用了這兩種信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因組修飾。生物通 www.ebiotrade.com
當(dāng)前，ZFNs被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但由于不可避免地生成雙鏈斷裂以及非同源末端連接的易出錯(cuò)性，利用可編程核酸酶進(jìn)行基因組工程操縱受到限制。并且，這些可編程核酸酶往往會(huì)在高度同源的位點(diǎn)誘導(dǎo)出隨機(jī)生成及不需要的缺失。而且核酸酶誘導(dǎo)太多脫靶雙鏈斷裂對(duì)細(xì)胞有害。此外，要正確地分離出基因靶向細(xì)胞也不是件容易的事情。
克服這些局限的一種潛在策略就是，靶向性導(dǎo)入到包含一個(gè)單鏈斷裂（SSB）或切口的DNA中。像雙鏈斷裂一樣，單鏈斷裂/切口理論上可以刺激同源重組修復(fù)信號(hào)通路。與雙鏈斷裂相比，切口或SSB不是非同源末端修復(fù)的底物。因此，靶向性SSB有潛力將修復(fù)限定至同源重組修復(fù)信號(hào)通路。生物通 www.ebiotrade.com
溶葡萄球菌素可由溶血性葡萄球菌自然生成，已有人提出用它來進(jìn)行全身性治療溶血性葡萄球菌感染。在小鼠模型中，溶葡萄球菌素已被證實(shí)能夠?qū)谷苎云咸亚蚓鸬娜橄傺住Ｓ醒芯繄?bào)道，乳汁中表達(dá)溶葡萄球菌素的轉(zhuǎn)基因牛能夠抵抗溶血性葡萄球菌乳房感染。然而在體外采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生成的溶葡萄球菌素由于糖基化有可能發(fā)生蛋白質(zhì)失活。因此，修改編碼序列生成Gln125,232-溶葡萄球菌素確保了兩個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)被移除。這可以防止蛋白質(zhì)糖基化并恢復(fù)部分蛋白質(zhì)活性。
在新研究中，研究人員的目的旨在通過在牛胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)將外源性Gln125,232溶葡萄球菌素基因插入到β-酪蛋白基因座中，進(jìn)行有效、可重現(xiàn)的基因靶向，從而使得基因靶向牛的乳腺能夠生成溶葡萄球菌素蛋白。生物通 www.ebiotrade.com
研究人員隨后證實(shí)了，在牛胚胎成纖維細(xì)胞中將ZFNickases靶向內(nèi)源β-酪蛋白基因座，通過同源重組修復(fù)刺激可添加溶葡萄球菌素基因。他們發(fā)現(xiàn)，ZFNickase處理細(xì)胞可成功用于體細(xì)胞核移植，生成了活產(chǎn)的基因靶向牛（gene-targeted cow）。并且，這些基因靶向牛的乳汁中分泌溶葡萄球菌素，體外分析證實(shí)這種牛奶能夠殺死金黃色葡萄球菌。研究人員表示，在這一策略上取得的成功將推動(dòng)新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)獲益。